本期細(xì)胞學(xué)堂為大家整理了A-498細(xì)胞的培養(yǎng)條件與傳代、凍存步驟及常見應(yīng)用，幫助您快速上手開展實驗。

A498細(xì)胞貼壁生長，呈上皮樣形態(tài)，細(xì)胞鋪開面積大，單位面積細(xì)胞總數(shù)量少，少量細(xì)胞有觸角；

低密度時可觀察到單個細(xì)胞清晰的邊緣，密度大于100%時邊緣不清晰，細(xì)胞與細(xì)胞之間沒有間隙；

細(xì)胞密度達(dá)80%-90%，即可進(jìn)行傳代培養(yǎng)；

棄去培養(yǎng)上清，用不含鈣、鎂離子的PBS潤洗細(xì)胞1-2次；

加1mL胰酶（含0.25% EDTA）于培養(yǎng)瓶中，置于37℃培養(yǎng)箱中消化2-3min，然后在顯微鏡下觀察細(xì)胞消化情況，若細(xì)胞大部分變圓、分離并脫落，迅速拿回操作臺，輕敲幾下培養(yǎng)瓶后加少量培養(yǎng)基終止消化；

按3-4mL/瓶補加培養(yǎng)基，輕輕打勻后吸出，在1000RPM條件下離心4min，棄去上清液，補加2-3mL培養(yǎng)液后吹勻；

收到細(xì)胞后首-次傳代推薦將細(xì)胞懸液按1:2的比例分到新的已添加好新鮮培養(yǎng)基的皿中或者瓶中，傳代后每個T25培養(yǎng)液總體積是5-6mL，后續(xù)傳代根據(jù)實際情況按1:2到1:4的比例進(jìn)行。

有血清程序凍存（需梯度降溫）：

配置凍存液，凍存液推薦配比：55%（基礎(chǔ)培養(yǎng)基）+40%(血清)+5%（DMSO）或90%胎牛血清+10%DMSO；

制備好的細(xì)胞懸液計數(shù)，計算總細(xì)胞量；

細(xì)胞離心后盡量吸干凈上清，離心轉(zhuǎn)速1200rpm（250g）3min；

加入配置好的凍存液重懸，調(diào)整細(xì)胞濃度為3×10⁶~1×10⁷cells/mL；

分裝入凍存管，一個凍存管分裝1~1.5mL；

推薦使用程序降溫盒，分裝好的凍存管轉(zhuǎn)入程序降溫盒后直接放入-80℃冰箱過夜；

從-80℃冰箱取出凍存管迅速轉(zhuǎn)移到液氮長期保存。